在CRISPR/Cas9基因編輯治療中，小型基因編輯工具可以搭載AAV病毒進(jìn)入體內(nèi)，是基因治療的理想工具。不同型號的基因編輯工具是否適合用于基因治療，取決于這把“魔剪”基因大小是否能搭載AAV病毒載體。

日前，復(fù)旦大學(xué)王永明課題組聯(lián)合王紅艷課題組從耳氏葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了一把小型的基因編輯工具并將其命名為SauriCas9。這把玲瓏的“剪刀”在基因組中可編輯的位點數(shù)量和經(jīng)典的SpCas9一樣多，而比另一種小型基因編輯工具SaCas9可編輯位點更多。該研究成果填補了我國在鑒定小型CRISPR/Cas9工具領(lǐng)域的空白。新的小型基因編輯工具的發(fā)現(xiàn)，彌補了現(xiàn)有基因編輯工具的不足。相關(guān)研究成果于近日在線發(fā)表于《公共科學(xué)圖書館：生物學(xué)》

兼具活性和編輯范圍優(yōu)勢

第三代基因編輯技術(shù)CRISPR技術(shù)讓基因治療的研究邁上了一個新臺階。在自然界中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，首先將入侵噬菌體和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR中，然后表達(dá)出相應(yīng)的CRISPR RNA(crRNA)來指導(dǎo)同源序列的降解，從而提供免疫性。王永明告訴科技日報記者，CRISPR/Cas9技術(shù)主要面臨兩個核心問題，一個是如何避免脫靶，另外一個是如何擴(kuò)展編輯范圍。新的小型基因編輯工具的發(fā)現(xiàn)主要針對后者展開的研究。

與其他小型基因編輯工具相比，SauriCas9相當(dāng)于一把靈活而鋒利的小型“剪刀”，能夠包裝在AAV病毒內(nèi)，且活性高，同時能夠?qū)崿F(xiàn)比以往發(fā)現(xiàn)的小型基因編輯工具更大的編輯范圍。SauriCas9通過AAV病毒包裝后，在多種細(xì)胞類型中實現(xiàn)了基因編輯，說明SauriCas9具有用于基因治療的潛力。

“SauriCas9基因大小為3100個堿基對，與另一種小型基因編輯工具SaCas9大小差不多，同時比經(jīng)典的SpCas9要小1000個堿基對。SaCas9比SpCas9小很多，但是編輯范圍不如SpCas9大。”王永明表示，SaCas9來源于金黃色葡萄球菌，是第一個被用于基因治療研究的小型基因編輯工具。另外還有3個小型編輯工具NmCas9、Nme2Cas9、CjCas9，但是它們的編輯效率偏低。SpCas9來源于化膿性鏈球菌，雖然編輯范圍大，但是不能被包裝在AAV病毒中，用于基因治療面臨困難。

基因編輯工具的來源不同，基因編輯范圍和效率也不同。SpCas9是所有基因編輯工具中效率最高的，同時編輯范圍也大。“SauriCas9出現(xiàn)兩個連續(xù)的G序列就可以進(jìn)行編輯，而SaCas9需要4個堿基組合才能編輯，這樣出現(xiàn)的頻率低，編輯范圍就不如SauriCas9大。”王永明說。

王永明課題組對公共數(shù)據(jù)庫中的30個不同種類CRISPR/Cas9進(jìn)行一一測試驗證，發(fā)現(xiàn)其他29個Cas9均不適合用于基因編輯，只有SauriCas9具有編輯活性，很適合作為基因編輯治療的工具。

用于藥物靶點的高通量篩選

CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括兩個元件，分別是Cas9內(nèi)切酶和guide RNA(gRNA)，gRNA引導(dǎo)Cas9蛋白在靶位點進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂(DSB)。細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)雙鏈斷裂的DNA時，會定點產(chǎn)生突變，這就是基因編輯。以往SpCas9通過與氨基酸融合實現(xiàn)堿基轉(zhuǎn)換。在發(fā)現(xiàn)了SauriCas9之后，研究團(tuán)隊將其與氨基酸融合制作了兩種新的堿基編輯器——SauriCas9BE4max和SauriCas9ABEmax，分別可以實現(xiàn)C-T或A-G兩種堿基轉(zhuǎn)換。“由于SauriCas9可以識別更多的位點，其編輯器的修復(fù)范圍也相應(yīng)比SaCas9更大。” 王永明說。

CRISPR/Cas9技術(shù)的安全性也是科學(xué)家研究的關(guān)注點，通常與基因編輯工具的精準(zhǔn)度相關(guān)。據(jù)王永明介紹，基因治療方式可以分為兩種，一種是將細(xì)胞從體內(nèi)分離出來，在體外進(jìn)行突變糾正，然后再輸回體內(nèi)。另外一種治療方式是將CRISPR/Cas9系統(tǒng)直接導(dǎo)入體內(nèi)治療疾病。但是CRISPR/Cas9技術(shù)可能會造成脫靶修飾，帶來難以預(yù)料的風(fēng)險。

SauriCas9的精準(zhǔn)度介于SpCas9與SaCas9之間。SaCas9的精準(zhǔn)度更好，意味著更具安全性。研究組將SauriCas9部分序列和SaCas9基因序列互換，得到了嵌合體Cas9，保證了精準(zhǔn)度的同時也能擴(kuò)大編輯范圍，使基因編輯工具得到了進(jìn)一步優(yōu)化。

后續(xù)的研究中，王永明課題組還將對新的基因編輯工具進(jìn)行安全性測試驗證，擴(kuò)展其在高通量篩選等方面的應(yīng)用。“人類大約有2萬個基因，利用CRISPR/Cas9可以分別敲除這2萬個基因，敲除過程可以用高通量實現(xiàn)，這樣就可以快速研究這些基因的功能，為藥物研發(fā)提供靶點。”王永明介紹。

(侯樹文 記者 王 春)